Новости

ИЗОЛИРОВАНИЕ ПОДКИСЛЕННЫМ СПИРТОМ

 

 

Методы изолирования подкисленным спиртом и подкисленной водой являются общими методами изолирования для всех пере­численных выше веществ.

Принцип изолирования алкалоидов подкисленным спиртом (метод Стаса-Отто). Извлечение тех или иных веществ, в част­ности из объектов биологического происхождения, основано на различной растворимости этих веществ в воде и органических растворителях (если вещество извлекается из смеси с другими твердыми веществами) и на законе распределения веществ меж­ду двумя несмешивающими жидкостями (если вещество экстра­гируется из раствора в какой-либо жидкости).

Принцип изолирования подкисленным спиртом впервые предложен для алкалоидов в 1851 г. известным бельгийским хи­миком Стасом и сводился к извлечению алкалоидов в виде их виннокислых или щавелевокислых солей этиловым алкоголем, выпариванию последнего на водяной бане при температуре 35°, обработке водой для удаления жиров, смол, красящих, дубиль­ных и других веществ, а затем к экстрагированию оснований алкалоидов эфиром.

В 1856 г. Юлий и Роберт Отто ввели в метод Стаса еще одну операцию - очистку остатка, исследуемого на алкалоиды, путем экстрагирования различного рода примесей эфиром из кислой жидкости.

В дальнейшем было замечено, что не все алкалоиды одинако­во относятся к различным органическим растворителям. Это да­ло повод разным авторам рекомендовать для экстрагирования алкалоидов, кроме эфира, уксусноэтиловый эфир (для морфи­на), хлороформ, бензин (для стрихнина), смесь хлороформа со спиртом, амиловый и бутиловый спирты и некоторые другие ор­ганические растворители, а для отделения сопутствующих алка­лоидам веществ - хлороформ, бензол, петролейный эфир и дру­гие растворители.

Для подкисления предлагались, кроме щавелевой кислоты, виннокаменная, уксусная, серная, соляная и другие кислоты, а для подщелачивания - едкие щелочи, гидроокись бария и дру­гие щелочные агенты. В разработку и усовершенствование мето­да Стаса много усилий вложили химики различных стран. Ме­тод претерпел серьезные изменения и был применен для изоли­рования из объектов биологического происхождения не только алкалоидов, но и многих других ядовитых и сильнодействующих веществ, имеющих токсикологическое значение.

Современная модификация метода извлечения подкисленным спиртом сводится к следующему. Тща­тельно измельченный объект (100-200 г внутренних органов. трупа) помещают в толстостенную колбу или банку, заливают 96° этиловым спиртом так, чтобы были покрыты твердые части объекта, и подкисляют 10% спиртовым раствором виннокамен­ной (или щавелевой) кислоты.

Когда исследуемый объект подкислен, колбу, не закрывая пробкой, встряхивают и спустя некоторое время (в неводных растворах и в гетерогенной среде время нейтрализации больше,, чем в воде) содержимое испытывают реакцией на универсаль­ный индикатор. Для этого каплю жидкости смешивают с каплей воды нейтральной реакции и смесью смачивают индикаторную бумагу - рН среды должен быть 2,5-3,0.

Пробирку закрывают неплотно (имеется в виду возможность продолжения выделения некоторого количества угольного ангид­рида), оставляют колбу на сутки в теплом месте (25-30°), ча­сто перемешивая ее содержимое. Спустя сутки убеждаются в сохранении кислой реакции. Тогда спиртовую вытяжку сливают и заменяют новой порцией спирта. Если через сутки реакция жидкости изменилась, стала нейтральной или щелочной, объект вновь подкисляют органической кислотой до рН 2,5-3,0 и снова оставляют на сутки. Операцию извлечения проводят 3-4 раза1.

Спиртовые вытяжки соединяют вместе, а биологический мате­риал промывают спиртом. Спирт присоединяют к слитым ранее порциям вытяжек. Извлечения отфильтровывают и сгущают до густоты сиропа под уменьшенным давлением2 или в фарфоровой чашке на водяной бане, имеющей температуру воды не выше 40° (во избежание разрушения таких веществ, как атропин, ко­каин, и некоторых других соединений, имеющих характер слож­ных эфиров). Сиропообразную жидкость обрабатывают 96°, а еще лучше абсолютным спиртом, приливая его по каплям и перемешивая жидкость стеклянной палочкой. Спирт добавляют до тех пор, пока не прекратится осаждение белков.

Осторожное добавление спирта вызывает осаждение белковых веществ в виде мелких хлопьев, не захватывающих раствора, что может иметь место при добавлении большого количества спирта сразу, когда осадок выделяется в виде больших сгустков.

Жидкость отстаивают, фильтруют, фильтр промывают спиртом и фильтрат упаривают до густоты сиропа при описанных выше условиях. В сиропообразном остатке снова осаждают белки, жидкость отстаивают и фильтруют. Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт перестанет что-либо осаждать. Тогда вытяжку упаривают до густоты сиропа и обрабатывают 20-25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильт­ровывают и тщательно промывают небольшим количеством воды.

Из водного раствора производят повторные извлечения (3-4 раза) небольшими порциями (по 10-15 мл) хлороформа сначала из кислой, а затем из щелочной (рН 10) среды. Подще-лачивание производят 25% раствором аммиака.

Удобство применения хлороформа в качестве растворителя за­ключается в том, что он достаточно хорошо растворяет большин­ство токсикологически важных органических веществ из группы изолируемых подкисленным спиртом и легко отделяется от вод­ного раствора.

Извлечение как из кислой, так и из щелочной жидкости долж­но производиться осторожно, лишь легким взбалтыванием или многократным перевертыванием делительной воронки, но отнюдь не энергичными встряхиваниями. Последние могут вызвать об­разование трудноразделимой эмульсии. Образовавшуюся эмуль­сию можно попытаться разрушить, добавив 0,5-1 мл спирта и поставив объект исследования в теплое место. Расслоение дости­гается при насыщении жидкости сульфатом аммония. Лучшим способом является центрифугирование.

Экстрагированием хлороформом сначала из кислого, а затем из щелочного раствора преследуется цель разделения веществ, изо­лируемых подкисленным спиртом, на две большие подгруппы: 1) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого раствора; 2) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из щелочного раствора.

Экстрагирование хлороформом из кислого водного раствора, кроме того, ставит своей задачей очистку жидкости от жира, красящих, дубильных и других веществ, мешающих дальнейше­му качественному обнаружению алкалоидов и других токсиколо­гически важных веществ основного характера.

Из числа веществ, представляющих токсикологический инте­рес, хлороформ экстрагирует из кислого раствора: 1) кислоты и их производные; 2) многоатомные фенолы; 3) некоторые вещест­ва нейтрального характера (полинитросоединения), производные анилина и парааминофенола; 4) слабые основания.

Все хлороформные извлечения из кислого раствора сливают вместе, фильтруют через возможно маленький фильтр и отдель­ные порции исследуют на наличие производных барбитуровой кислоты и таких слабых оснований, как стрихнин, бруцин, кофе­ин и др.

При наличии наводящих указании (характерная окраска хло­роформного извлечения или остатка по удалении растворителя, например в присутствии пикриновой кислоты, кристаллическое строение при наличии полинитропроизводиых, фенацетина и т. п.), так же как п при специальных запросах, круг исследова­ний в той или иной степени расширяется или суживается.

Практически в большинстве случаев бывает достаточно 3- 4-кратного экстрагирования. Хлороформные вытяжки из щелоч­ного раствора также сливают вместе, промывают небольшим ко­личеством воды, фильтруют через возможно маленький фильтр и хлороформ выпаривают при комнатной температуре в неболь­шой фарфоровой или стеклянной чашке. Остатки по удалении хлороформа исследуют на наличие алкалоидов и синтетических лекарственных веществ (см. стр. 160).

Достоинства и недостатки метода изолиро­вания подкисленным спиртом. Удобство применения этилового спирта для изолирования разнообразных органиче­ских веществ из объектов биологического происхождения заклю­чается в его способности хорошо растворять многие органиче­ские вещества, а также свертывать, переводить в нерастворимое состояние белки - главную составную часть большинства объек­тов химико-токсикологического исследования (внутренние орга­ны трупов, пищевые продукты животного происхождения и т. п.). При этом неизбежны потери искомых веществ, так как свернув­шийся белок удерживает ту или иную часть их.

Метод изолирования подкисленным спиртом обладает рядом недостатков, к числу которых относятся следующие:

а)    длительность настаивания объектов со спиртом, а также
упаривания спиртовых вытяжек и удаления осажденных белков;
в общей сложности обработка занимает 8-10 рабочих дней и
больше (в случае упаривания спиртовых вытяжек на теплой во­
дяной бане в открытых фарфоровых чашках);

б)    большое количество операций, связанных с очисткой спир­
товой вытяжки от белков и продуктов белкового распада;

в)    возможность потери малых количеств алкалоидов и других
веществ основного характера как вследствие сорбции их белка­
ми и фильтровальной бумагой (особенно при многократном
фильтровании), так и в результате продолжительного нагрева­
ния кислого раствора;

г)    относительная дороговизна метода, так как на каждое ис­
следование, например, внутренних органов трупа расходуется
до 500 мл 96° этилового спирта. Все это приводит к тому, что
классический метод Стаса-Отто как общий метод теряет свое
значение и постепенно заменяется более быстрыми, эффективны­
ми и более экономичными методами, хотя он еще и сохраняет
свою роль при изолировании некоторых веществ, плохо раство­
римых в воде, а также при исследовании биологических объек­
тов в сильно гнилостном виде.



29.06.2015